生物物理所揭示EBV致癌蛋白組裝與激活機制
| 來源： 生物物理研究所 【字號：大 中 小】
7月11日，中國科學院生物物理研究所高璞、高光俠、張立國合作團隊，在《細胞》（Cell）上發(fā)表了題為Assembly and activation of EBV latent membrane protein 1的研究論文。該研究報道了EBV（Epstein-Barr Virus）關鍵致癌蛋白潛伏期膜蛋白1（LMP1）自組裝和組成性激活的分子基礎，發(fā)現了LMP1以全新且與此前猜測完全不同的機制進行寡聚自組裝，并通過巧妙方式高效招募下游因子，從而激活和維持致病信號的活化。該研究發(fā)現的新機制和新界面有望助力LMP1靶向干預策略的開發(fā)工作。
EBV是一種人類皰疹病毒，也是首個被報道的人類腫瘤病毒。雖然EBV通常不產生嚴重癥狀，但EBV感染有幾率導致多種淋巴癌和上皮細胞癌。
LMP1是EBV編碼的關鍵致癌蛋白。1985年，Elliott Kieff課題組首次報道LMP1單一蛋白表達即能夠誘發(fā)B細胞的永生化，后續(xù)研究相繼發(fā)現LMP1通過模擬CD40信號參與B細胞和上皮細胞增殖和早期癌變。與CD40不同，LMP1信號的激活不依賴任何配體，且LMP1介導的信號強度強于CD40。除了介導細胞轉化和永生化，LMP1還參與調控多種重要生命活動，包括免疫應答、細胞因子和趨化因子分泌、細胞凋亡、細胞遷移、細胞互作、腫瘤侵襲和轉移等。鑒于LMP1與EBV致病的高度關聯性，以及LMP1在EBV相關惡性腫瘤中的廣泛表達和分布，LMP1被認為是EBV陽性腫瘤鑒別診斷和靶向治療的理想靶點。盡管目前對LMP1介導的下游功能已有較多認識，但作為產生多樣性功能的核心前提即LMP1如何實現配體不依賴的組裝和激活仍是難題，也是LMP1靶向干預策略開發(fā)的阻礙。
該研究利用共聚焦顯微鏡進行細胞成像，發(fā)現LMP1在生理表達水平下會在膜上呈現出明顯的聚集形態(tài)。進一步的超分辨成像表明，LMP1的聚集是寬度較為固定但長度不均一的細條狀結構。這表明LMP1可在膜上組裝成有序的聚集體，但其分子層面的細節(jié)尚不清楚。為回答這一問題，科研人員計劃解析LMP1在不同組裝狀態(tài)下的精細結構。然而，這一目標具有挑戰(zhàn)性，原因在于性質良好的LMP1蛋白較難大量制備，LMP1核心跨膜區(qū)僅~20 KDa且?guī)缀鯚o可識別的穩(wěn)定水溶區(qū)。
經過大量嘗試，該研究解決了LMP1難表達、難純化的問題。生化分析提示LMP1在溶液存在不同聚集狀態(tài)。為輔助結構解析，該研究進一步開展了系統(tǒng)性LMP1抗體篩選，獲得了能夠穩(wěn)定結合LMP1跨膜區(qū)的鼠源單抗。研究通過抗體輔助策略解析了LMP1兩種聚集態(tài)結構——軸對稱二聚體和纖維狀高聚體。LMP1單體以全新的方式進行跨膜區(qū)折疊，進而通過反向平行疊合形成穩(wěn)定的二聚體結構；LMP1二聚體是其進行更高級組裝的基本單元，多個二聚體以并行的方式自組裝形成纖維狀高聚結構。這些高分辨率的結構信息符合活細胞成像所觀測到的獨特聚集形態(tài)，從而在不同分辨率尺度上揭示了LMP1的膜上聚集機制。
由于目前PDB數據庫中尚無任何LMP1的同源結構，而LMP1多種狀態(tài)的真實結構均與通過AlphaFold2/3等軟件預測的結果不同。同時，這種差異體現在結構折疊的差異，并預測模型中的基本拓撲學走向亦是錯誤的。這提示在沒有同源結構訓練的情況下，對于預測結構的使用需格外謹慎。從另一個角度來說，該研究獲得的LMP1多種聚集狀態(tài)的真實結構，為后續(xù)預測訓練提供了全新且獨立的折疊方式及組裝模式。
為進一步明確LMP1的功能形式，該工作對二聚體和寡聚體界面分別進行系統(tǒng)突變，發(fā)現其均會破壞LMP1在活細胞中的膜聚集形態(tài)，且均能阻斷下游信號通路的活化。這證明了LMP1分子間互作的重要性，并明確了LMP1的寡聚纖維結構才是其真正的激活狀態(tài)。超分辨成像結果表明，LMP1在膜上的自發(fā)形成的纖維狀聚集包含幾十至數百個LMP1二聚體單元。LMP1的這種聚集在很低蛋白水平下即可發(fā)生且隨著LMP1含量增加，同時，多聚體的數量、強度和長度均顯著增長。這是首次在較低表達水平下系統(tǒng)性觀察到LMP1在膜上的超分辨動態(tài)聚集和組裝。
作為LMP1的功能相關蛋白，宿主膜受體CD40的激活需依賴其配體介導的三聚體組裝；LMP1和CD40共同的下游信號因子TRAF蛋白以三聚體形式發(fā)揮功能。因此，長期以來，普遍推測LMP1應是采用三聚體的方式來組裝，這樣才能更好地與下游因子進行銜接。然而，LMP1是以二聚體為單元進行并行方式的纖維自組裝。那么，LMP1是如何有效協(xié)調信號轉導？分析發(fā)現，二聚體單元中的兩個LMP1的C端，可以和鄰近二聚體中一個LMP1的C端，在空間上呈現近似等邊三角形的巧妙排列。由于C端延伸的水溶區(qū)負責招募下游因子，因而這種纖維自組裝方式結構上等價于多個LMP1“三聚體”平行密集排列，從而能夠比CD40更高效招募下游因子和進行信號轉導。研究證實，如果將CD40 負責下游因子招募的C端水溶區(qū)連接到LMP1的跨膜區(qū)上，那么這種嵌合體蛋白的信號激活能力強于原始的CD40。同時，研究通過生化手段在體外重組LMP1與TRAF復合體，利用電鏡直接觀察到LMP1的纖維聚集可以同時招募多對TRAF三聚體。LMP1這種多位點且組成性的下游蛋白招募、激活方式，促進了信號轉導強度，并有效維系了持續(xù)的增殖、癌變信號。
研究工作得到國家自然科學基金委員會、科學技術部、中國科學院以及北京市等的資助。相關實驗得到生物物理所蛋白質科學研究平臺的支持。
CD40與LMP1的不同激活機制
